由于具有無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、高靈敏度和檢測信號改善等多種優(yōu)勢，比率型納米熒光探針在生物體內(nèi)動態(tài)檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在體內(nèi)研究中，比率傳感的可靠性受到越來越多的關(guān)注。發(fā)射波長較短(<700 nm)的比率納米探針在組織中容易受到光散射和自熒光干擾，疊加在光譜上導(dǎo)致體內(nèi)傳感準(zhǔn)確度降低。由于具有降低的光散射和組織自發(fā)熒光，近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光探針廣泛用于活體深層組織的傳感。最近的一些研究基于發(fā)射波長接近的熒光團(tuán)具有類似的光-物質(zhì)相互作用的光譜比率或頻率濾波等光學(xué)方法優(yōu)化了NIR-II納米比率探針在體內(nèi)傳感中的可靠性。然而，在生物介質(zhì)中，由于探針的環(huán)境敏感特性及其與血清蛋白的強(qiáng)非特異性相互作用，NIR-II比率型納米熒光探針普遍存在難以通過光學(xué)方法優(yōu)化的光譜偏移和失真等問題，這阻礙了其在體內(nèi)各種生物過程研究時(shí)的可靠性。
示意圖. 光-組織和比率探針-環(huán)境的相互作用可使光譜畸變和移動，降低檢測的可靠性。
鑒于此，團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地開發(fā)了一種在膠束中摻雜共價(jià)連接的熒光分子二聯(lián)體(Dyad)的策略，大大提高了NIR-II比率型納米熒光探針的光譜保真度，用于可靠的體內(nèi)生物檢測。在血清溶液中，摻雜共價(jià)連接熒光分子的納米探針的光譜保真度比摻雜非共價(jià)混合熒光團(tuán)的納米探針提高了9.4倍，對ONOO-的檢測準(zhǔn)確度提高了22.5倍。該比率型納米探針可以用于評估創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后的體內(nèi)氧化應(yīng)激水平動態(tài)變化及腦損傷的治療預(yù)后，且檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果高度一致，表明其在體內(nèi)高保真檢測中具有重要應(yīng)用潛力。
考慮到在NIR-II窗口具有較大的斯托克斯（Stokes）位移的熒光團(tuán)可以盡可能多的過濾組織自身熒光，作者首先合成了一個Stokes位移有145 nm、最大發(fā)射為995 nm、化學(xué)穩(wěn)定性高的非對稱氮雜Bodipy (aBOP)作為FRET供體；另外，發(fā)射波長接近的兩個熒光團(tuán)具有相似組織衰減系數(shù)，通過對其發(fā)射光譜的兩個區(qū)域進(jìn)行比值可以獲得更可靠的比率結(jié)果。基于此，作者設(shè)計(jì)了光譜匹配的菁染料(IR1110)作為FRET受體，并進(jìn)一步在中位引入了提供電子的噻吩基團(tuán)，使其對ROS具有高敏感性。得到的IR1110對ONOO-有特異性的快速熒光ON-OFF響應(yīng)，其機(jī)制可能是IR1110被ONOO-單電子氧化，然后在C1/C1'位置裂解。作者設(shè)想aBOP和IR1110之間的FRET相互作用可以用于炎癥疾病中ONOO-信號的比率傳感評估。然而，aBOP和IR1110的熒光光譜能否在血液等生物介質(zhì)中保持穩(wěn)定影響了檢測的可靠性。首先，作者測試了染料的環(huán)境敏感性，結(jié)果顯示aBOP和IR1110的光譜都是溶劑敏感的。為了模擬探針-血液相互作用，作者將aBOP和IR1110分別封裝到DSPE-PEG2000聚合物膠束中，然后與胎牛血清(FBS)溶液共孵育。隨著孵育時(shí)間的增加，aBOP膠束顯示出發(fā)射強(qiáng)度衰減和發(fā)射波長藍(lán)移，而IR1110膠束相對穩(wěn)定。盡管如此，供體aBOP的光譜不穩(wěn)定性可以傳遞給受體IR1110，導(dǎo)致?lián)诫s非共價(jià)混合熒光團(tuán)的納米探針的光譜失真。通過比較aBOP和IR1110的分子量、疏水表面積和LogP，發(fā)現(xiàn)這些值與染料在FBS溶液中的光譜保真度呈正相關(guān)。因此，作者合理推測具有大分子量、強(qiáng)疏水性的分子傾向于被鎖定在膠束內(nèi)部，進(jìn)而可以獲得一個受保護(hù)的穩(wěn)定光譜。為了增加探針的分子量、疏水表面積和LogP，作者采用了分子二聯(lián)體(Dyad)設(shè)計(jì)策略，通過共價(jià)連接氨基修飾的供體和羧基修飾的受體構(gòu)建了分子探針aBOP-IR1110。由于分子量(1710 Da)、疏水性(LogP=12.36)的增加，在與FBS溶液共孵育12 h后，包裹在聚乙二醇膠束中的同濃度的aBOP-IR1110納米探針比摻雜非共價(jià)混合熒光團(tuán)的納米探針(aBOP/IR1110)的光譜保真度 提高了至少9.4倍，表明摻雜Dyad分子的納米探針具有高保真?zhèn)鞲械臐摿Α?/p>
圖1. aBOP-IR1110納米探針的設(shè)計(jì)、制備及其在血清中光譜穩(wěn)定性表征
隨后作者對該納米探針的檢測能力和可靠性進(jìn)行了評估。與ONOO- (0-16當(dāng)量)反應(yīng)后，該探針在950-1200 nm (F950LP)和1100-1200 nm(F1100LP)范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度比(F950LP/F1100LP)隨著ONOO-濃度的增加呈線性增強(qiáng)，所有反應(yīng)在35s內(nèi)完成，具有實(shí)時(shí)檢測的能力。重要的是，在相同條件下，與ONOO-反應(yīng)后，相比于摻雜非共價(jià)aBOP/IR1110的納米探針，摻雜共價(jià)aBOP-IR1110的納米探針在FBS溶液中顯示出22.5倍和2.3倍的比率光譜保真度，表明該納米探針具有可靠地檢測ONOO-的能力。這可歸因于aBOP-IR1110與ONOO-的反應(yīng)產(chǎn)物也具有較大的分子量(1483 Da)和較高的疏水性(LogP=7.87)。另外，該探針可以特異性的檢測細(xì)胞內(nèi)源性上調(diào)生成的ONOO-，并能對不同炎癥程度的細(xì)胞中生成的ONOO-水平進(jìn)行區(qū)分，表明該探針具有在活體內(nèi)高保真地檢測炎癥的潛力。
圖2. aBOP-IR1110納米探針在體外檢測ONOO-中的表征
由于ONOO-水平通常與創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的疾病進(jìn)程及藥物治療效果密切相關(guān)，于是作者研究了aBOP-IR1110納米探針在TBI小鼠模型中的檢測能力。TBI后不同時(shí)間的氧化應(yīng)激水平不同，該納米探針在損傷不同時(shí)間(0-14天)后的TBI小鼠腦組織中出顯著差異的比率信號強(qiáng)度，且比率熒光檢測結(jié)果與腦梗死染色、腦組織H&E染色及血液免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果高度一致，表明該探針能夠可靠地用于實(shí)時(shí)評估體內(nèi)TBI的進(jìn)程。
圖3. aBOP-IR1110納米探針用于監(jiān)測腦損傷的疾病進(jìn)程
接下來，作者評估了該納米探針在用于評估TBI藥物的治療效果的可行性。由于損傷后氧化應(yīng)激水平處于動態(tài)變化且不明確，藥物靶點(diǎn)和治療窗口難以準(zhǔn)確評估，影響了藥物效力降低和TBI的預(yù)后。基于此，作者檢測了損傷后不同時(shí)間(0, 3, 12 h)注射抗氧化藥物依達(dá)拉奉的TBI小鼠腦組織中的比率熒光信號強(qiáng)度。與12小時(shí)相比，損傷后0和3小時(shí)注射藥物的TBI小鼠的比率熒光信號值顯著降低，指示合適的治療窗口為0-3小時(shí)。腦梗死染色、腦組織H&E染色及血液免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果進(jìn)一步佐證了比率熒光檢測結(jié)果，表明該納米探針可以在體內(nèi)及時(shí)可靠地評估TBI藥物的治療效果和合適的治療窗口。
圖4. aBOP-IR1110納米探針用于評估腦損傷藥物的治療效果
團(tuán)隊(duì)通過在聚乙二醇膠束中引入NIR-II共價(jià)連接的二元分子探aBOP-IR1110，開發(fā)了一種可在體內(nèi)應(yīng)用的可靠的比率熒光納米探針。增加的分子量、LogP和疏水性aBOP-IR1110納米傳感器在生物介質(zhì)中具有高保真光譜，在特異性比率測定ONOO-方面表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測準(zhǔn)確度。結(jié)合長發(fā)射波長在組織穿透方面的優(yōu)勢，該納米探針在體內(nèi)實(shí)時(shí)評估TBI進(jìn)展和治療窗口具有較強(qiáng)的可行性和可靠性。因此，這種實(shí)時(shí)檢測體系在未來指導(dǎo)新藥開發(fā)、制定個性化的治療方案方面具有很大的應(yīng)用潛力，這種化學(xué)設(shè)計(jì)策略還可以擴(kuò)展到制備各種NIR-II納米探針，以可靠地檢測體內(nèi)其他生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn)：
Peng Yu, Kui Yan, Shangfeng Wang,* Chenzhi Yao, Zuhai Lei, Yaohui Tang, and Fan Zhang*，NIR-II Dyad-Doped Ratiometric Nanosensor with Enhanced Spectral Fidelity in Biological Media for In Vivo Biosensing. Nano Lett., 2022, 22, 23, 9732-9740.
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